转录组差异表达分析小实战(二)

差异基因表达分析

我按照前面的流程转录组差异表达分析小实战(一),将小鼠的4个样本又重新跑了一遍,从而获得一个新的count文件:mouse_all_count.txt,有需要的话,可以下载下来进行后续的差异分析。

一般来说,由于普遍认为高通量的read count符合泊松分布,所以一些差异分析的R包都是基于负二项式分布模型的,比如DESeq、DESeq2和edgeR等,所以这3个R包从整体上来说是类似的(但各自标准化算法是不一样的)。

当然还有一个常用的R包则是Limma包,其中的limma-trend和limma-voom都能用来处理RNA-Seq数据(但对应适用的情况不一样)

下面准备适用DESeq2和edgeR两个R包分别对小鼠的count数据进行差异表达分析,然后取两者的结果的交集的基因作为差异表达基因。

  1. DEseq2

    library(DESeq2)
    ##数据预处理
    database <- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = "\t", header = T, row.names = 1)
    database <- round(as.matrix(database))
    
    ##设置分组信息并构建dds对象
    condition <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2)), levels = c("control", "Akap95"))
    coldata <- data.frame(row.names = colnames(database), condition)
    dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=database, colData=coldata, design=~condition)
    dds <- dds[ rowSums(counts(dds)) > 1, ]
    
    ##使用DESeq函数估计离散度,然后差异分析获得res对象
    dds <- DESeq(dds)
    res <- results(dds)
    
    #最后设定阈值,筛选差异基因,导出数据(全部数据。包括标准化后的count数)
    res <- res[order(res$padj),]
    diff_gene <- subset(res, padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1 | log2FoldChange < -1))
    diff_gene_DESeq2 <- row.names(diff_gene)
    resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)
    write.csv(resdata,file = "control_vs_Akap95.csv",row.names = F)
    

    最终获得572个差异基因(筛选标准为padj < 0.05, |log2FoldChange| > 1)

  2. edgeR

    library(edgeR)
    ##跟DESeq2一样,导入数据,预处理(用了cpm函数)
    exprSet<- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = "\t", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE)
    group_list <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2)))
    exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,]
    
    ##设置分组信息,并做TMM标准化
    exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list)
    exprSet <- calcNormFactors(exprSet)
    
    ##使用qCML(quantile-adjusted conditional maximum likelihood)估计离散度(只针对单因素实验设计)
    exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet)
    exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet)
    
    ##寻找差异gene(这里的exactTest函数还是基于qCML并且只针对单因素实验设计),然后按照阈值进行筛选即可
    et <- exactTest(exprSet)
    tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet))
    diff_gene_edgeR <- subset(tTag$table, FDR < 0.05 & (logFC > 1 | logFC < -1))
    diff_gene_edgeR <- row.names(diff_gene_edgeR)
    write.csv(tTag$table,file = "control_vs_Akap95_edgeR.csv")
    

    最终获得688个差异基因(筛选标准为FDR < 0.05, |log2FC| > 1)

  3. 取DESeq2和edgeR两者结果的交集

    diff_gene <- diff_gene_DESeq2[diff_gene_DESeq2 %in% diff_gene_edgeR]
    

    最终的差异基因数目为545个

    head(diff_gene)
    [1] "ENSMUSG00000003309.14" "ENSMUSG00000046323.8"  "ENSMUSG00000001123.15"
    [4] "ENSMUSG00000023906.2"  "ENSMUSG00000044279.15" "ENSMUSG00000018569.12"
    
  4. 其他两个R包(DESeq和limma)就不在这尝试了,我之前做过对于这4个R包的简单使用笔记,可以参考下:
    简单使用DESeq做差异分析
    简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析
    简单使用limma做差异分析

GO&&KEGG富集分析

以前一直没有机会用Y叔写的clusterProfiler包,这次正好看说明用一下。

  1. GO富集,加载clusterProfiler包和org.Mm.eg.db包(小鼠嘛),然后将ENSEMBL ID后面的版本号去掉,不然后面不识别这个ID,然后按照clusterProfiler包的教程说明使用函数即可。

    library(clusterProfiler)
    library(org.Mm.eg.db)
    
    ##去除ID的版本号
    diff_gene_ENSEMBL <- unlist(lapply(diff_gene, function(x){strsplit(x, "\\.")[[1]][1]}))
    ##GOid mapping + GO富集
    ego <- enrichGO(gene = diff_gene_ENSEMBL, OrgDb = org.Mm.eg.db, 
            keytype = "ENSEMBL", ont = "BP", pAdjustMethod = "BH", 
            pvalueCutoff = 0.01, qvalueCutoff = 0.05)
    ##查看富集结果数据
    enrich_go <- as.data.frame(ego)
    ##作图
    barplot(ego, showCategory=10)
    dotplot(ego)
    enrichMap(ego)
    plotGOgraph(ego)
    
  2. KEGG富集,首先需要将ENSEMBL ID转化为ENTREZ ID,然后使用ENTREZ ID作为kegg id,从而通过enrichKEGG函数从online KEGG上抓取信息,并做富集

    library(clusterProfiler)
    library(org.Mm.eg.db)
    
    ##ID转化
    ids <- bitr(diff_gene_ENSEMBL, fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", OrgDb = "org.Mm.eg.db")
    kk <- enrichKEGG(gene = ids[,2], organism = "mmu", keyType = "kegg",
             pvalueCutoff = 0.05, pAdjustMethod = "BH", qvalueCutoff = 0.1)
    ##查看富集结果数据
    enrich_kegg <- as.data.frame(kk)
    ##作图
    dotplot(kk)
    

到这里为止,转录组的差异表达分析算是做完了,简单的来说,这个过程就是将reads mapping 到reference上,然后计数获得count数,然后做差异分析,最后来个GO KEGG,over了。。。

对于mapping和计数这两部还有其实还有好多软件,具体可见文献:Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis,有时间可以都尝试下。

至于GO && KEGG这两步,对于人、小鼠等模式物种来说,不考虑方便因素来说,完全可以自己写脚本来完成,数据可以从gene ontology官网下载,然后就是GO id与gene id相互转化了。KEGG 也是一样,也可以用脚本去KEGG网站上自行抓取,先知道URL规则,然后爬数据即可。