简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析

DESeq2和EdgeR都可用于做基因差异表达分析,主要也是用于RNA-Seq数据,同样也可以处理类似的ChIP-Seq,shRNA以及质谱数据。

这两个都属于R包,其相同点在于都是对count data数据进行处理,都是基于负二项分布模型。因此会发现,用两者处理同一组数据,最后在相同阈值下筛选出的大部分基因都是一样的,但是有一部分不同应该是由于其估计离散度的不同方法所导致的。

DESeq2的使用方法:

  1. 输入矩阵数据,行名为sample,列名为gene;DESeq2不支持无生物学重复的数据,因此我选择了2个样本,3个生物学重复的数据;并对count data取整(经大神指点,这里需要说明下,我的测试数据readcount是RSEM定量的结果,并不是常见的htseq-count的结果,所以count值会有小数点,而DESeq2包不支持count数有小数点,所以这里需要round取整)。

    database_all <- read.table(file = "readcount", sep = "\t", header = T, row.names = 1)
    database <- database_all[,1:6]
    #type <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))
    database <- round(as.matrix(database))
    
  2. 设置分组信息以及构建dds对象

    condition <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))
    coldata <- data.frame(row.names = colnames(database), condition)
    dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=database, colData=coldata, design=~condition)
    
  3. 使用DESeq函数进行估计离散度,然后进行标准的差异表达分析,得到res对象结果

    dds <- DESeq(dds)
    res <- results(dds)
    
  4. 最后设定阈值,筛选差异基因,导出数据

    table(res$padj <0.05)
    res <- res[order(res$padj),]
    resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)
    write.csv(resdata,file = "LC_1_vs_LC_2.csv")
    

EdgeR的使用方法:

  1. 跟DESeq2一样,EdgeR输入矩阵数据,行名为sample,列名为gene;DESeq2不支持无生物学重复的数据,因此我选择了2个样本,3个生物学重复的数据。

    exprSet_all <- read.table(file = "readcount", sep = "\t", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE)
    exprSet <- exprSet_all[,1:6]
    group_list <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))
    
  2. 设置分组信息,去除低表达量的gene以及做TMM标准化

    exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,]
    exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list)
    exprSet <- calcNormFactors(exprSet)
    
  3. 使用qCML(quantile-adjusted conditional maximum likelihood)估计离散度(只针对单因素实验设计

    exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet)
    exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet)
    
  4. 寻找差异gene(这里的exactTest函数还是基于qCML并且只针对单因素实验设计),然后按照阈值进行筛选即可

    et <- exactTest(exprSet)
    tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet))
    tTag <- as.data.frame(tTag)
    write.csv(tTag,file = "LC_1_vs_LC_2_edgeR.csv")
    

Summary

以上我主要针对单因素两两比较组进行差异分析,其实DESeq2和EdgeR两个R包都可以对多因素进行差异分析。

  1. DESeq2修改以上代码的分组信息design参数以及在差异分析results函数中添加所选定的分组因素,其他代码基本一样,具体参照DESeq2手册

  2. EdgeR则需要用Cox-Reid profile-adjusted likelihood (CR)方法来估算离散度,y <- estimateDisp(y, design)或者分别使用三个函数(y <- estimateGLMCommonDisp(y, design),y <- estimateGLMTrendedDisp(y, design), )y <- estimateGLMTagwiseDisp(y, design);然后差异表达分析也跟单因素分析不同,主要使用generalized linear model (GLM) likelihood ratio test 或者 quasi-likelihood(QL) F-test,具体代码可以参照EdgeR手册。