mRNA文库构建

RNA-seq测序方法

  1. 在测mRNA过程中,首先要去除rRNA。以人为例,在抽提的总RNA中,95%的RNA是rRNA,2%的RNA是mRNA,剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。

  2. rRNA整个人类当中是非常保守的,在各个组织器官中也是非常稳定的,因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。

  3. Illumina公司的Truseq RNA建库方法是应用最广泛的一种,真核普通转录组为例:

    • 首先以mRNA的Poly(A)(高等生物特有的)这个特点,让带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交,使mRNA和磁珠相结合在一起。
    • 接着回收磁珠,将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
    • 然后用镁离子溶液将洗脱下来的mRNA打成片段,被打断的mRNA片段用随机引物逆转录出第一链的cDNA,再合成出第二链,这样就有了双链cDNA。
    • 对双链cDNA末端修复,加A加接头。
    • 片段选择,PCR扩增、纯化(如果样本中存在污染物,则需要结合试剂盒进一步纯化)。

注:

  1. 这个建库方法对mRNA的完整性有较高要求,因此如果mRNA发生降解,那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA断片,会在富集阶段被洗脱,导致最后数据有一定的偏差(在RNA测序质控时就能发现mRNA的3’端以及5’端是否有偏移)。

  2. 一般在会测序前对总RNA进行一次质检,根据电泳质检结果中的18S和28S(rRNA)两个峰的高度以及峰的尖度来判断RNA的质量,峰越高越尖(RIN > 8.0)表示RNA的完整度越好。

  3. 除了mRNA普通文库构建外,还有真核链特异性文库、lncRNA文库、SmallRNA文库等

  4. 针对一些FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本以及原核生物的总RNA中去除rRNA,不适合用上述mRNA建库方法。需要结合RiboZero、RiboMinus等来去除,其实是针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理来去除的。

以上主要参考陈巍学基因视频:
RNASeq方法及应用
http://blog.sciencenet.cn/blog-1333578-819475.html